1、收集樣品

2、相關(guan) 試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預混試劑)。

3、實驗儀(yi) 器 熒光定量PCR儀(yi) ; PCR儀(yi) ;低溫離心機。

4、總RNA提取

5、cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體(ti) 係。混勻後70℃變性RNA 5分鍾，冰上速冷1分鍾，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體(ti) 係。PCR儀(yi) 中反應條件設置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應。合成好的cDNA置於(yu) -20 ℃保存備用。

6、引物設計與(yu) thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成

7、實時定量PCR 按以下反應體(ti) 係進行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上遊引物F 1 ul，下遊引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀(yi) 擴增反應條件設置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個(ge) 循環)。

8、PCR產(chan) 物溶解曲線分析 將所擴增的PCR 產(chan) 物進行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴增產(chan) 物單一，無非特異性擴增產(chan) 物。溶解曲線生成的反應程序為(wei) : 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。

注意事項：收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定，對收集後當天進行檢測的標本，儲(chu) 存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，將標本及時分裝後放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反複凍融，標本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個(ge) 月，-70度可保存6個(ge) 月，部分標本需添加抑肽酶。