小分子越來越難做，大分子發展很強勢，似乎成為(wei) 了近年來藥物研發市場的重要表現之一，“多肽"類藥物正是其中的一大熱門。目前多肽藥物的質量監管日趨漸嚴(yan) ，在這種趨勢下，尋找能滿足更高分離度，靈敏度的分析方法就顯得尤為(wei) 重要。很多小夥(huo) 伴在在開發多肽類樣品分析方法中總是遇到各種的問題，無比煩惱。這裏就總結了一些在多肽方法開發中常見的問題分享給各位小夥(huo) 伴。

1、多肽含量與(yu) 多肽純度有什麽(me) 區別？

一條多肽產(chan) 品中除了多肽本身還包括生產(chan) 過程中帶入的水份及有機鹽分等雜質，多肽純度僅(jin) 指多肽本身所含肽產(chan) 品的含量及雜質的含量，不包括水份等雜質；而多肽含量則是指目標多肽在產(chan) 品中的淨含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來檢測；因此一條多肽即使純度達到99%，因為(wei) 產(chan) 品中還包含水份及有機鹽分等，它的含量可能也隻有70-80%。

2、如何溶解多肽？

多數多肽都可以用超純水溶解，對於(yu) 一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對於(yu) 酸性多肽，可先以小量堿性（如0.1%氨/水）溶液溶解，然後稀釋至所需濃度，對於(yu) 堿性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三fu乙酸）溶液溶解，然後稀釋至所需濃度，對於(yu) 疏水性多肽，可用有機溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。

3、為(wei) 什麽(me) 流動相中要加入三fu乙酸作為(wei) 離子對試劑，還有哪些流動相體(ti) 係或離子對試劑可用於(yu) 多肽的分離純化？

加入三fu乙酸能調節洗脫液的PH，同時作為(wei) 離子對試劑與(yu) 多肽相互作用，從(cong) 而增強分離效果，明顯改善峰形。

其它可用於(yu) 多肽分離純化的流動相體(ti) 係或離子對試劑包括醋酸體(ti) 係，磷酸體(ti) 係，鹽酸體(ti) 係，七氟丁/酸等通過適當的調節PH都能取得很好的分離效果。

另外三fu乙酸優(you) 於(yu) 其他離子修飾劑的原因是它容易揮發，可以方便地從(cong) 製備樣品中除去，另一方麵，三fu乙酸的紫外最大吸收峰低於(yu) 200nm，對多肽在低波長處的檢測幹擾很小。

4、檢驗多肽的色譜柱出現柱壓升高，柱效下降該如何解決(jue) ？

日常對色譜柱衝(chong) 洗維護可以遵循色譜柱出廠說明書(shu) ，但是在分析多肽等蛋白質樣品時還容易出現一種現象：蛋白汙染。主要是柱頭端填料出現結塊，如果出現蛋白汙染，建議使用yi腈-水-三fu乙酸 = 50-50-0.1小流速反向衝(chong) 洗60倍柱體(ti) 積或者反向衝(chong) 洗過夜。

5、多肽樣品在新的矽膠基質色譜柱上不出峰或者峰麵積異常小，這是為(wei) 什麽(me) ？

這是因為(wei) 全多孔球形矽膠柱上的非特異吸附位點對多肽產(chan) 生死吸附從(cong) 而導致不出峰。

色譜柱中非特異性吸附位點主要來源於(yu) 殘留的矽醇基、矽膠中的殘留重金屬、鍵合相脫落後暴露的矽羥基，柱管內(nei) 壁沒有被鈍化的位點。這些都會(hui) 對多肽樣品有較強的非特異性吸附。

其實在開始使用新色譜柱時，對生物樣品這樣的非特異性吸附會(hui) 比較嚴(yan) 重，可以對色譜柱進行高濃度樣品飽和處理。在正式檢測前預先進樣，使樣品在柱子上累積，覆蓋住這樣的位點，才會(hui) 使我們(men) 以後的分析有好的色譜圖。建議隔一分鍾進一次樣，連續進十幾針，用過量樣品覆蓋掉非特異性吸附位點。等峰麵積，峰形穩定後就可以正式檢測樣品。

6、TFA在緩衝(chong) 液中是不是隻起到調節PH的作用？TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說TFA的濃度在緩衝(chong) 液PH允許的情況下越低越好？

（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度，會(hui) 使溶液偏酸，長時間使用可能影響柱子壽命。

（2）同時TFA可以抑製矽膠表麵矽醇基，改善堿性化合物的峰型。有時0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完後及時衝(chong) 洗色譜柱。

7、在多肽檢測過程中經常出現基線漂移的原因是什麽(me) ？怎麽(me) 解決(jue) ？

固定三fu乙酸濃度的梯度洗脫有時會(hui) 在210-220nm檢測處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。

降低或消除由於(yu) 三fu乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測波長靠近215nm，並在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三fu乙酸補償(chang) 基線漂移。例如溶劑A中的三fu乙酸為(wei) 0.1%時，溶劑B中可用0.085%。

8、如何選擇純化過程中使用的色譜柱填料？

不同序列的多肽理化性質及疏水性有很大的區別，多數情況分子量小於(yu) 4000和親(qin) 水性多肽用Ｃ18柱分離效果z佳，分子量大於(yu) 5000和j端疏水性的多肽以Ｃ4柱分離效果z佳，而Ｃ8柱介於(yu) Ｃ18和Ｃ4柱之間，其應用效果與(yu) Ｃ18柱更相似；對一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱。