一、實驗目的
通過檢測處於(yu) 凋亡狀態的細胞數量來檢驗目的基因與(yu) 細胞凋亡的關(guan) 聯或者藥物對細胞凋亡的影響。

二、實驗原理
在正常的活細胞中，磷脂酰絲(si) 氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位於(yu) 細胞膜的內(nei) 側(ce) ，但在早期凋亡細胞中，PS 從(cong) 細胞膜的內(nei) 側(ce) 翻轉到細胞膜的表麵，暴露在細胞外環境中。

Annexin-Ⅴ能與(yu) PS 高親(qin) 和力結合。可通過細胞外側(ce) 暴露的磷脂酰絲(si) 氨酸與(yu) 凋亡早期細胞的胞膜結合。用標記了 FITC 的 AnnexinⅤ作為(wei) 熒光探針，利用流式細胞儀(yi) 或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。細胞壞死的過程中也會(hui) 發生細胞膜損傷(shang) ，壞死的細胞會(hui) 結合 Annexin V-FITC。

Annexin V-FITC 通常與(yu) 細胞膜非滲透性核酸熒光染料聯合使用以檢測凋亡細胞。常用的染料是 PI。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI 能夠透過細胞膜與(yu) 細胞核結合呈現紅色。

將 AnnexinⅤ與(yu) PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。壞死細胞可以同時與(yu) Annexin V-FITC 和 PI 結合顯色，而 PI 則被排除在活細胞 (FITC 陰性) 和早期凋亡細胞 (FITC 陽性) 之外。在沒有巨噬細胞的情況下，凋亡的最後階段會(hui) 像細胞壞死一樣發生整個(ge) 細胞的解體(ti) ，從(cong) 而使凋
亡晚期的細胞也同時被 FITC 和 PI 結合染色呈現雙陽性。

三、實驗步驟
1. 待各實驗組 6 孔板細胞生長至覆蓋率約為(wei) 70% 時，收集上清，胰酶消化貼壁細胞，完quan培養(yang) 基重懸成細胞懸液，與(yu) 上清細胞收集於(yu) 同一 5 mL 離心管中，每組設三個(ge) 複孔 (為(wei) 保證上機細胞數足夠，細胞數目 ≥ 5×105/處理）。若為(wei) 懸浮細胞，直接收集。
2.1000 g 離心 5 分鍾，棄上清，用 PBS 輕輕重懸細胞；
3.1000 g 離心 5 分鍾，棄上清，加入 195μl Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞。
4. 加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
6. 使用鋁箔進行避光，室溫 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分鍾，孵育過程中重懸細胞 2-3 次，隨後置於(yu) 冰浴中。
7. 立即上機檢測

四、常見問題及解答
Q1：構建了慢病毒轉染的穩轉株（帶綠色熒光），檢測凋亡使用 FITC 也是綠色熒光，是否會(hui) 幹擾？
A：會(hui) 有幹擾，可以換紅色熒光標簽的試劑進行檢測。

Q2：鏡下觀察有很多漂浮細胞，可以看到凋亡，為(wei) 什麽(me) 染色後跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：將漂浮的細胞收集起來再進行實驗

Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦顯微鏡下分別選擇的測量波長是多少？
A：綠色熒光可以使用 488nm 激發，PI 是紅色熒光，使用 535nm 激發

Q4：FITC 和 PI 孵育時間過短，對結果有什麽(me) 影響？
A：孵育時間過短，影響裝載效果，時間過長，也要考慮細胞本身的狀態。

Q5：想問一下用流氏檢測應該怎麽(me) 設門？
A：用陰性未染色的細胞調電壓，門設置，annexin V-FITC 單染、PI 單染來調補償(chang) 。