病毒核酸檢測(nucleic acid test，NAT)現已廣泛應用於(yu) 血液及其製品的病毒篩查、臨(lin) 床抗病du藥物治療療效監測等。但核酸檢測容易受到檢測樣本的基質效應和檢測病毒的基因變異等多種因素的影響，使得不同的實驗室應用不同的方法學進行核酸檢測的結果，在量值、靈敏度和特異性方麵常出現較大的差異。為(wei) 使不同實驗室，不同方法間檢測的結果具有可比性，就必須使檢測標準化， 而標準物質是檢測標準化的核心。

標準物質的種類

由於(yu) 血清中病毒核酸的量值不能單獨應用物理和(或)化學的方法進行準確測定，必須通過一定的核酸擴增或雜交過程並經相應的數據處理後才能推測出血清中病毒核酸的原始數值。所以傳(chuan) 統意義(yi) 的一級參考測量程序(物理和化學方法)和一級標準物質在核酸檢測中還不存在。病毒核酸檢測標準物質目前通常分為(wei) 國際標準物質、國家或地區標準物質和實驗室內(nei) 部的工作製劑等三個(ge) 等級。

1.核酸檢測用國際標準物質(reference material)

是指由WHO 多中心研究後由專(zhuan) 門委員會(hui) 認可的，經過穩定性和組成完整性檢驗的，在國際範圍內(nei) 用作有關(guan) 量的其他標準定值基礎的物質，目前均由英國國家生物學標準物質和質控物研究所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)研製並提供。NIBSC於(yu) 1997年建立了第一代HCVRNA 核酸檢測用國際標準，分別於(yu) 1999年、2000年、2002年和2003年建立了第一代HIVG1 RNA、HBV DNA、Human parvovirus B19和HAV RNA 核酸檢測用國際標準(表9G1)。核酸檢測用國際標準物質沒有高純度要求，其產(chan) 量也沒必要滿足常規實驗室要求，通常製備一批次可供5～10年應用。

2.國家或地區標準物質

主要麵向一個(ge) 國家或地區。在有國際標準物質的情況下，可溯源至國際標準，如衛生部臨(lin) 床檢驗中心研製的HBV DNA 和HCV RNA 國家標準物質。在沒有國際標準的情況下，國家標準物質管理組織可以建立國家標準物質並自行規定單位，諸如意大利HCV RNA 國家標準物質。

3.實驗室內(nei) 部用的核酸檢測工作製劑

是指相關(guan) 診斷試劑生產(chan) 廠家，在實際工作中用於(yu) 校準或檢查實物量具、測量儀(yi) 器或標準物質的工作標準。如Roche、Chiron 和Bayer等公司自己用的核酸檢測工作標準國家或地區標準物質和實驗室內(nei) 部的工作製劑等的量值應溯源至國際標準物質。其測定值的不確定度也應大於(yu) 並包含上一級標準物質的不確定度。

標準物質的製備

目前，病毒核酸檢測用國際標準物質的製備已經程序化，HCV RNA、HIVG1 RNA、HBV DNA、Humanparavo virus B19和HAV RNA的第一代國際標準物質，都是按照WHO 的固定程序製備的。

其過程包括原材料的選擇和分裝、穩定性和均勻性檢驗、多中心合作研究定值、WHO認可三個(ge) 階段。

下文就原材料的選擇和分裝進行介紹。

一、原材料的選擇原則

在選擇用於(yu) 製備病毒核酸標準物質的原材料時，通常應該遵循如下基本原則。

1.基質相同或相近的原則

核酸檢測用標準物質所選的原始材料，基質應和使用的要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基質效應引入的係統誤差。如臨(lin) 床日常檢測的標本使用的是血清(漿)，則相應標準物質的基質也應是血清(漿)；如臨(lin) 床標本的基質為(wei) 細胞，則標準物質的基質亦應為(wei) 細胞。目前WHO認可的核酸用國際標準物質所選的原始材料，是應用混合的陰性血漿[HBGsAg(-)、抗HCV(-)、HCV RNA(-)、HIV 抗原檢測(-)、HIVG1 RNA(-)、HAV RNA(-)和Parvovirus B19(-)]稀釋陽性血漿得到，陽性血漿中含有相應經過滅活處理的野生型病毒。

2. 原始材料的均勻性原則

由於(yu) 原始材料可能為(wei) 多個(ge) 來源，因此必須嚴(yan) 格混勻以保證材料的均勻性。原始材料可以分成相同的幾份或不同的幾份，一次製備兩(liang) 批次或多批次的候選國際標準物質，如NIBSC在製備第一代HCV 核酸檢測用國際標準時，除製備了兩(liang) 批次凍幹粉候選標準物質外，還製備了一批次的液體(ti) 候選標準物質，這樣可以監測製備過程對標準物質的影響是否相同和選擇國際標準的最佳保存形態。

3.有代表性及靶病原體(ti) 含量高的原則

篩選的自然存在的病毒應具有代表性，並且目的分析物含量要高。要注意病毒的不同的基因型的分布、病毒核酸常用於(yu) 核酸擴增檢測區域的保守性，避免使用含有已發生變異的特殊病毒的原材料。

4.容易大量獲得

易大量獲得，可有效地保證標準物質的製備原材料有足夠的來源，一次也可大量製備，也可有效地保證成品的均一性。

5.無純度要求

用於(yu) 病毒核酸製備的原材料可以是純的病原體(ti) 或培養(yang) 物，也可以是混雜在臨(lin) 床標本的混合物，隻要其基質中不含影響檢測的物質即可。

6.生物安全性

用於(yu) 病毒標準物質製備的原材料一般均來自於(yu) 感染者的標本，均具有生物傳(chuan) 染危險性，因此，在不影響靶核酸的穩定性的情況下，應盡可能在製備前進行滅活處理。理想情況下，是采用無生物傳(chuan) 染危險性的原材料如體(ti) 外克隆表達的病毒樣顆粒來製備。

7.防汙染

處理原始材料時，要注意防止物理、化學和微生物方麵的汙染。

8.人工合成的病毒核酸的篩選

選擇人工合成的病毒核酸作為(wei) 相應標準物質製備的原材料時，合成核酸片段序列選擇、長度和理化特性應適用於(yu) 臨(lin) 床使用的商品試劑盒，特別要注意的是適用於(yu) 不同的核酸純化方法。其生物安全性、易獲得性、使用的方便程度均應明顯好於(yu) 天然候選物。但裸露的RNA 容易受核糖核酸酶的降解而穩定性差。

二、原材料的分裝

標準物質在液體(ti) 分裝時，會(hui) 造成分裝體(ti) 積的不均勻。因此在分裝過程中，每隔一定數量都會(hui) 抽取一分裝單位進行稱量，並通過稱量結果計算分裝的變異係數。如NIBSC在製備病毒核酸檢測用HAV RNA、HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA和B19 DNA國際標準時，采用稱重的方法確定分裝的不確定度分別為(wei) 0.29% 或0.39%、3.2%、0.4%和0.6%、0.63%和0.71%。並在分裝時盡量避免生物的，化學的或灰塵汙染，操作可以在清潔級的房間內(nei) 操作或在配備高效微粒空氣過濾器的層流櫃中操作。分裝應盡快在短時間內(nei) 完成，以確保同一批次所有的分裝單元是在同一時間同樣條件下分裝。

此外，分裝用分配器、檢測用儀(yi) 器均應進行校準。所有用於(yu) 製備的玻璃器皿或一次性消耗品均應經過高壓滅菌消毒。用於(yu) 製備RNA的玻璃器皿應經過去核糖核酸酶的處理，一次性消耗品應為(wei) 無脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的製品。