對於(yu) 陽性對照品和陰性對照品您了解多少?

陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控製品，同時也作為(wei) 判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與(yu) 檢測標本的組成相一致。以人血清為(wei) 標本的測定，對照品最好也為(wei) 人血清，因為(wei) 正常人血清在各種ELISA模式中可產(chan) 生不同程度的本底。由於(yu) 大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以複鈣人血漿為(wei) 原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊後所得的液體(ti) ，其組成與(yu) 血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩衝(chong) 液為(wei) 基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書(shu) 中標明。加入的量應與(yu) 試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與(yu) 受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個(ge) 粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為(wei) 0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為(wei) 10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

包被用抗體(ti)

包被固相載體(ti) 的抗體(ti) 應具有高親(qin) 和力和高特異性，可取材於(yu) 抗血清或含單克隆抗體(ti) 的腹水或培養(yang) 液。如免疫用抗原中含有雜質(即便是極微量的)，在抗血清中將出現雜抗體(ti) ，必須除去(可用吸收法)後才能用於(yu) ELISA，以保證試驗的特異性。抗血清不能直接用於(yu) 包被，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用於(yu) 包被，高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親(qin) 和力的抗體(ti) 包被以提高試驗的敏感性，則可采用親(qin) 和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親(qin) 和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋後直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅(jin) 針對一種抗原決(jue) 定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

包被的條件

包被用抗原或抗體(ti) 的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。抗體(ti) 和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩衝(chong) 液作為(wei) 稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩衝(chong) 液及pH7~8的Tris-HCL緩衝(chong) 液作為(wei) 稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液後，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為(wei) 具有同等的包被效果。包被的適當濃度隨載體(ti) 和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與(yu) 酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為(wei) 100ng/ml-20ug/ml。

包被的方式

將抗原或抗體(ti) 固定在過程稱為(wei) 包被。換言之，包被即是抗原或抗體(ti) 結合到固相載體(ti) 表麵的過程。蛋白質與(yu) 聚苯乙x固相載體(ti) 是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與(yu) 固相載體(ti) 表麵的疏水基團間的作用於(yu) 。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體(ti) 對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體(ti) 表麵。IgG對聚苯乙x等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fc段上，抗體(ti) 結合點暴露於(yu) 外，因此抗體(ti) 的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與(yu) 抗體(ti) 相似的方法包被。當抗原決(jue) 定簇存在於(yu) 或鄰近於(yu) 疏水區域時，抗原與(yu) 固相載體(ti) 的直接吸附可使抗原決(jue) 定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體(ti) 作預包被，其後通過抗原抗體(ti) 反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體(ti) 表麵，其抗原決(jue) 定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體(ti) 的親(qin) 和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重複性亦佳。間接包被的另一優(you) 點是抗原用量少，僅(jin) 為(wei) 直接包被的1/10乃至於(yu) /100。不易吸附在聚苯乙x載體(ti) 上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體(ti) 時，需用DNA作為(wei) 包被抗原，而普遍的固相載體(ti) 一般不能直接與(yu) 核酸結合。可將聚苯乙x先經紫外線照射，以增加其吸附性能。固相載體(ti) 先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親(qin) 和素生物素係統作間接包被，即用親(qin) 和素先包被載體(ti) ，然後加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用於(yu) 各種抗原物質的定量測定。

脂類物質無法與(yu) 固相載體(ti) 結合，可將其在有機溶劑中溶解後加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹幹，待酒精揮發後，讓脂質自然幹固在固相表麵。抗心磷脂抗體(ti) 的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

洗板方法：

1.手工洗板方法：吸去或甩掉酶標板內(nei) 的液體(ti) ;在實驗台上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩衝(chong) 液至少0.3ml注入孔內(nei) ，浸泡1-2分鍾，根據需要，重複此過程數次。

2.自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。待檢樣本：體(ti) 液、血清、血漿、細胞培養(yang) 上清液、尿液、組織勻漿、心房水標本等。

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