細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，利用凍存技術將細胞冷凍保存在-196℃液氮中，可以使細胞暫時停止生長並保留細胞特性，以便在需要時再複蘇細胞用於(yu) 實驗。同時保存適量的細胞，可以防止細胞在培養(yang) 過程中因受到汙染或其他意外事件導致細胞丟(diu) 種，起到細胞保種的作用。

一、冷凍“慢條斯理"，複蘇“眼疾手快"

細胞凍存和複蘇采取“慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細胞內(nei) 的水份滲出細胞外，減少細胞內(nei) 形成冰晶的機會(hui) ；快融以保證細胞外結晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細胞內(nei) ，再次形成胞內(nei) 冰晶造成對細胞的損傷(shang) 。

二、“高高興(xing) 興(xing) 上班，平平安安回家"

細胞凍存時需向培養(yang) 基中加入冷凍保護劑，可保護細胞在冷凍時免受溶液損傷(shang) 和冰晶損傷(shang) 。冷凍保護劑可根據其是否穿透細胞膜分為(wei) 滲透性和非滲透性兩(liang) 類：

1、滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nei) ，一般是一些小分子物質，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2、非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nei) ，一般是些大分子物質，主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。

三、細胞凍存的“按部就班"

1、準備已滅菌的凍存培養(yang) 液，並4℃預冷；

2、選取對數生長期的細胞，棄掉細胞培養(yang) 液，用細胞消化酶（如胰蛋白酶）進行消化，適時去掉消化液，加入少量新鮮培養(yang) 液。懸浮生長的細胞不進行消化處理，直接將細胞收集於(yu) 離心管中離心，1000 rpm，5-10 min；

3、棄去上清液，逐漸加入適量預冷的凍存培養(yang) 液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節細胞濃度在5×106～1×107/mL之間；

4、將上述細胞分裝於(yu) 2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL。在凍存管上標明細胞名稱、凍存日期和操作者；

5、凍存：標準的降溫速率開始為(wei) -1～-2℃/ min，當溫度降到-80℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然後放入-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nei) 。

四、細胞複蘇的“按部就班"

1、從(cong) 液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，並不時搖動使其盡快融化；

2、從(cong) 37℃水浴中取出凍存管，在無菌條件下取出細胞，加到離心管並滴加10倍以上培養(yang) 液，混勻，以1000 rpm，5-10 min離心；

3、棄去上清液，加入適量培養(yang) 液重懸細胞，計數，調整細胞密度後接種到培養(yang) 瓶中，37℃培養(yang) 箱靜置培養(yang) ；

4、次日更換一次培養(yang) 液，繼續培養(yang) 。

五、前方高能預警

1、配製好的細胞凍存液要進行預冷，新鮮配製的凍存液會(hui) 產(chan) 生大量的熱。

2、凍存的細胞在半年後，建議取出一隻凍存管細胞複蘇培養(yang) ，觀察生長情況，然後再繼續凍存。