今天我們(men) 就來看看在細胞培養(yang) 過程中血清使用方麵常見的問題，如：血清儲(chu) 存條件、如何程序解凍、細胞汙染與(yu) 血清之間的關(guan) 係、傳(chuan) 說中的“黑膠蟲"是什麽(me) 以及血清熱滅活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器"，通過今天的解析與(yu) 學習(xi) 可以讓我們(men) 在做細胞培養(yang) 相關(guan) 實驗時事半功倍！

Q1：血清長期儲(chu) 存的條件和方法是什麽(me) ？
A1：血清如需長期保存，則必須儲(chu) 存於(yu) -10℃或更低溫冰箱中，建議存放於(yu) -20℃的冰箱中。研究表明儲(chu) 存在-80℃條件下的血清在性能方麵變化不大，但由於(yu) 解凍時溫差過大，會(hui) 導致析出更多沉澱，使得背景雜亂(luan) ，因此血清長期保存不建議處於(yu) -80℃條件下。如果近期會(hui) 頻繁使用血清，我們(men) 建議不要在4℃條件下存放超過1個(ge) 月，若一次無法用完整瓶建議分裝後保存，且要避免反複凍融。另外，血清冰凍後體(ti) 積會(hui) 增加約10%，因此血清分裝時請留意預留一定的體(ti) 積空間。

Q2：如何進行血清的程序性解凍？血清才不會(hui) 使產(chan) 品質量受損？
A2：程序性解凍血清可以確保血清製品質量的穩定性，且不會(hui) 因為(wei) 溫差過大而析出過多蛋白等沉澱。程序性解凍方法是於(yu) 實驗開始之前將冷凍的血清置於(yu) 4℃冰箱中融解，並且在解凍過程中每隔1小時搖勻一次，使溫度與(yu) 成分均一，減少沉澱析出，直至全部解凍，然後再移入室溫條件下使用。

Q3：血清解凍後發現絮狀沉澱該如何處理？
A3：造成血清發生絮狀沉澱的原因主要是血清解凍過程中溫差帶來了脂蛋白變性和纖維蛋白析出，沉澱本身不會(hui) 影響血清質量，也不會(hui) 對實驗結果造成影響。但如必須處理沉澱，則可通過離心方式去除，如500-1000×g離心5-10 min。

Q4：血清沉澱是什麽(me) ？
A4：用於(yu) 細胞培養(yang) 的胎牛血清及其他血類製品中均存在各種類型的沉澱，如纖維蛋白和磷酸鈣等。一些絮狀沉澱主要就是纖維蛋白，通常我們(men) 肉眼可見，大小在1-2mm之間；而磷酸鈣在顯微鏡下觀察呈現布朗運動的小黑點，通常被誤認為(wei) 是微生物汙染。血清沉澱往往比較難以預測和控製，但幸運的是這些沉澱不會(hui) 影響血清品質。

Q5：血清中的小黑點是“黑膠蟲"麽(me) ？
A5：血清解凍過程溫差過大、經反複凍融或通過熱滅活處理後更容易產(chan) 生沉澱，這些沉澱物在鏡下觀察時有一些會(hui) 呈現以布朗運動的小黑點，業(ye) 內(nei) 流行一種“黑膠蟲"汙染的說法，但“黑膠蟲"一直以來都是極為(wei) 神秘的存在，至今科學家們(men) 也沒有完整的實驗結果可以證實它究竟是一種生物還是非生物，更有人認為(wei) “黑膠蟲"是血清的原蟲，或誤以為(wei) 是細菌或真菌汙染。但科學家通過進一步的研究發現它們(men) 更可能是血清中的蛋白結晶。這種結晶可能為(wei) 蛋白析出，如纖維蛋白原凝結成纖維蛋白；或是鹽析出，如磷酸鈣等；也有一些是膽固醇和脂肪酸。

Q6：如何判斷血清汙染？
A6：
1、首先檢查並判斷外包裝是否有破損，一般瓶身破損的血清發生汙染的可能性極大；

2、將血清接種到血酯板上，培養(yang) 後看是否有菌落形成；

3、可通過質量檢測試劑盒檢測結果判定，如支原體(ti) 檢測試劑盒等。血清汙染主要包括細菌汙染、真菌汙染和支原體(ti) 汙染。在細胞培養(yang) 時想要確定血清存在細菌汙染，可嚐試使用5-10倍濃度青鏈黴素雙抗衝(chong) 擊培養(yang) 24-48h；真菌汙染的細胞無法搶救，應立即將細胞瓶進行高壓滅菌處理，並消毒培養(yang) 箱；支原體(ti) 汙染可考慮更換早期代次細胞，或使用商品化支原體(ti) 去除試劑。

Q7：細胞形態不正常、生長狀態異常或增殖速率緩慢是否與(yu) 血清有關(guan) ？
A7：細胞形態異常需要綜合關(guan) 注細胞代次、傳(chuan) 代操作、培養(yang) 基和血清等諸多因素。如傳(chuan) 代次數過多或傳(chuan) 代時間過晚都有可能影響細胞的生長狀態。有些細胞對血清具有一定適應性，更換新批次血清時可能出現所含因子水平的差異而導致的細胞生長狀態受到影響的現象，可以通過血清梯度替換或者增加細胞適應時間來解決(jue) 此類問題。與(yu) 此同時也要關(guan) 注基礎培養(yang) 基和傳(chuan) 代操作等方麵是否存在一定問題。

Q8：如何做血清的梯度替換？
A8：當細胞培養(yang) 實驗需更換血清品牌時，做程序性梯度替換方案尤為(wei) 重要，因為(wei) 不同品牌的血清所含成分有所差異，血清更換會(hui) 使細胞發生不適，從(cong) 而出現細胞增殖緩慢或細胞狀態不佳等情況。建議的梯度替換方法為(wei) ：培養(yang) 基配置過程中先用25%新血清與(yu) 75%原血清進行混合，培養(yang) 傳(chuan) 代1-2次；而後用50%新血清與(yu) 50%原血清混合培養(yang) 傳(chuan) 代；再用75%新血清與(yu) 25%原血清混合培養(yang) 傳(chuan) 代；最後使用新血清培養(yang) 傳(chuan) 代。

Q9：培養(yang) 基中添加血清和抗生素後可長期保存嗎?
A9：新鮮培養(yang) 基中添加血清和抗生素後，建議在2周內(nei) 使用完。

Q10：血清的熱滅活是必須的嗎?
A10：實驗表明，經熱滅活處理的血清對細胞生長可能僅(jin) 有微小促進或沒有任何作用，甚至通常因高溫處理而損失掉血清中部分營養(yang) 成分從(cong) 而影響血清質量，造成細胞生長速率降低。熱滅活過程中因局部溫度過高、搖晃不均勻或滅活時間過長，都會(hui) 造成血清品質下降，且經熱滅活後的血清會(hui) 增加發生蛋白沉澱概率。因此，若非必須血清不需要做熱滅活，而少數對補體(ti) 敏感的細胞實驗，如某些免疫學實驗或腺病毒包裝等，可酌情對血清進行熱滅活操作。

Q11：血清熱滅活應如何操作？
A11：
1、熱滅活前，必須先將解凍後的血清搖勻，並恢複至室溫；

2、取部分搖勻血清置於(yu) 50ml離心管中，並準備同規格對照管一個(ge) ；

3、對照管內(nei) 加入血清等體(ti) 積水；

4、對照管內(nei) 插入溫度計進行溫度預試，當溫度達到 56℃時將恢複至室溫的血清放入水浴鍋30min；

5、滅活過程中需要每隔5min輕輕晃動搖勻，以保證溫度均一。

Q12：血清為(wei) 什麽(me) 存在批間差？
A12：血清批間差是客觀存在的，因為(wei) 血清製品來源於(yu) 天然活體(ti) ，供體(ti) 牛隻的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養(yang) 環境的地形、風貌、飲食、水源等影響，體(ti) 內(nei) 各類蛋白、生長因子和酶類的含量均有巨大差異，所以血清具有含量複雜且不固定的特性，批間差異在所難免，因此批間差異小的血清不僅(jin) 可以保證血清質量，確保細胞培養(yang) 效果，還能減少由於(yu) 批間差異帶來的使用前測試，且避免實驗結果的不可重複性。